Впервые Кейли Куоко предстала перед телекамерами в 8 месяцев — снялась в рекламе детских игрушек. С трёх лет она занималась теннисом и мечтала стать знаменитой спортсменкой. Но, забавы ради, ходила с друзьями в студию актёрского мастерства. В 6 лет её снова пригласили на съёмки. На этот раз Кейли появилась в рекламных сюжетах, посвящённых куклам Барби, а вскоре начала участвовать и в театральных постановках пьес «Энни» и «Скрипач на крыше». В 2002 году ей предложили одну из главных ролей в комедийном сериале «8 простых правил для друга моей дочери-подростка». В 2005 году Кейли получила роль Билли в последнем сезоне «Зачарованных».

В 2007 году начала сниматься в одной из главных ролей в сериале «Теория Большого взрыва», который позже стал одним из самых просматриваемых сериалов на американском телевидении. В 2008 году она снялась в одном из эпизодов сериала «Побег».

11-12 сентября 2010 во время урока верховой езды упала с лошади и сломала ногу. Осматривая повреждение в госпитале, хирург сказал, что одним из возможных вариантов может оказаться ампутация ноги. К счастью, до этого не дошло, но принять участие в съёмках следующих двух серий «Теории Большого взрыва» она не смогла, так что в них пришлось менять сценарий. В нескольких следующих сериях сценарий также был изменён, чтобы не было заметно гипса на ноге. По словам Кейли, её ногу скрывали примерно так же, как у актрис из сериалов обычно «прячут» беременность. Вместо обычной роли официантки она в этих сериях играла роль бармена за стойкой. С 2016 года занимает второе место в ежегодном рейтинге Forbes «Самые высокооплачиваемые актрисы телевидения»